产品货号:
ALH133
中文名称:
细菌基因组DNA快速提取试剂盒
英文名称:
Bacterial genomic DNA Rapid Extraction Kit(adsorption column)
产品规格:
50T|100T|200T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒适用于快速提取各种细菌基因组DNA。独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。
- 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
- 不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
- 快速,简捷,单个样品操作一般可在30分钟内完成。
- 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9,长度可达30kb~50kb,可直接用于PCR,Southern-blot和各种酶切反应。
组分 | 50T | 100T | 200T |
平衡液 | 5mL | 10mL | 20mL |
缓冲液RB | 30mL | 60mL | 120mL |
结合液CB | 11mL | 20mL | 40mL |
抑制物去除液IR | 25mL | 50mL | 100mL |
漂洗液WB | 13mL | 25mL | 50mL |
洗脱缓冲液EB | 15mL | 20mL | 40mL |
蛋白酶K溶液,20mg/mL | 1mL | 1mL×2 | 1mL×4 |
吸附柱AC | 50个 | 100个 | 200个 |
收集管(2mL) | 50个 | 100个 | 200个 |
保存:室温,有效期一年。
- 结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
- 蛋白酶K保存在即用型甘油缓冲液中,常温运输。收到后,不超过25℃室温至少保存6个月,4℃保存12个月,-20℃保存2年。
- 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
- 第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
- 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
- 开始实验前根据需要将水浴预热到37℃或者70℃备用。
- 需要自备异丙醇。
- 需自备0.5M EDTA、Triton X-100和Lysozyme(溶菌酶,用于革兰氏阳性菌)。
- 结合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
- 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保批pH大于7.5,pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在-20℃。DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。
- 取0.5~2毫升培养菌液(最多不超过2×109个细胞),10000rpm,离心30秒,尽可能的吸弃上清,收集菌体。
- 起始处理量可以根据细菌密度、细胞种类、预期产量进行调整,但是离心吸附柱最大吸附能力是20μg基因组DNA,如果菌体过量超过最大吸附能力,反而会严重降低产量。
- 加入200μL缓冲液RB重悬,10000rpm离心30秒,弃上清。将细胞振荡或者吹打充分重悬于180μL缓冲液RB中。
- 对于较难破壁的革兰氏阳性菌,可略过第2步骤,加入溶菌酶进行破壁处理,具体方法为:加入180μL缓冲液(20mM Tris,pH8.0;2mM Na2-EDTA;1.2%Triton X-100;临用前加入终浓度为20mg/mL的溶菌酶(溶菌酶必须用溶菌酶干粉溶解在缓冲液中进行配制,否则会导致溶菌酶无活性)),37℃处理30min以上。
- 加入20μL蛋白酶K (20mg/mL)溶液,充分混匀,再加入200μL结合液CB,立刻涡旋振荡充分混匀,在70℃放置10分钟。
- 可选做步骤:如果RNA残留较多,需要去除RNA,可以在加入200μL结合液CB前加20μL RNase A(25mg/mL)溶液,振荡混匀,室温放置5~10分钟。
- 冷却后加入100μL异丙醇,立刻涡旋振荡充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
- 上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要,混匀不充分严重降低产量,必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。
- 将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13000rpm离心30~60秒,倒掉收集管中的废液。
- 平衡液预处理吸附柱备用,使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤,具体方法参见附录参考“关于平衡液的使用”。
- 加入500μL抑制物去除液IR,12000rpm离心30秒,弃废液。
- 加入600μL漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12000rpm离心30秒,弃掉废液。
- 加入600μL漂洗液WB,12000rpm离心30秒,弃掉废液。
- 将吸附柱AC放回空收集管中,13000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
- 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65~70℃水浴中预热效果更好),室温放置3~5分钟,12000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12000rpm离心1分钟。
- 洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于30μL,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。
- DNA可以存放在2~8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃
关于平衡液的使用
- 介绍:核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团,提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液,若不小心碰到,请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖,以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成,请加热至37℃使沉淀完全消失。
- 使用方法:取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中,吸取100μL的平衡液至柱子中。13000rpm离心1分钟,倒掉收集管中废液,将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。
问题 | 分析 |
DNA产量低 |
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未提取到DNA |
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洗脱下来的DNA产量低 |
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A260吸光值异常偏高 |
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DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全 |
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